石墨烯在生物医用领域的应用研究进展
2017-08-07

一、石墨烯概述

  石墨烯(Graphene)是一种由sp2杂化的碳原子呈蜂窝状结构紧密排列而成的单原子层二维材料。Andre Geim和Konstantin Novoselov于2004年首次通过微机械力剥离高取向热解石墨(HOPG)成功制备并观察石墨烯,二人因此分享2010年诺贝尔物理学奖。


  源于其特殊的单原子层二维结构,石墨烯在电子学、光学、力学和热学等方面拥有出色的性能。2012年,Nature发表了关于石墨烯的前瞻性文章,指出石墨烯在电子学(柔性电子材料、高频晶体管、逻辑晶体管等)、光子学(光电探测器、光调制器、锁模激光/太赫兹信号发生器、光学偏振控制器等)、复合材料、涂料、能源、传感器和生物医用等领域具有良好的应用前景[1]。碳元素是有机生物体的基本组成元素之一,而且经研究证实,经一定修饰的石墨烯确实具有良好的生物相容性,故石墨烯在生物医学领域具有天然的优势。2008年,戴宏杰课题组基于石墨烯材料首次实现药物传送,开启了石墨烯在生物医用领域研究和应用的新纪元[2]。由于真正意义上的石墨烯难以实现宏量制备,因此实际应用多为石墨烯衍生物,包括少层石墨烯(2~10层)、多层石墨烯(10层以上,但厚度小于100nm)、氧化石墨烯(GO)与经还原的氧化石墨烯(rGO)等。目前,石墨烯和其衍生物经研究证实可应用于药物基因输送、复合材料、肿瘤光热治疗、生物成像、电化学生物传感器、抗菌和组织工程等生物医用相关领域。

二、石墨烯在生物医用领域的应用进展

1.石墨烯的结构性质相关应用

  石墨烯尤其GO比表面积大,并且在水中有很好的分散性。GO表面含有丰富的含氧官能团,能将各种药物和生物分子通过化学方式固定在其表面,故在药物和基因输送领域具有良好的应用前景。由于呈非水溶性,一些具有良好疗效的芳香族药物难以实现实际应用。戴宏杰课题组通过非共价的π-π相互作用成功将非水溶性抗肿瘤药物喜树碱衍生物(SN38)负载到经聚乙二醇修饰的GO表面,可很好分散在水中并保持其出色疗效,证明石墨烯是一种出色的药物载体[2]。陈永胜课题组成功将盐酸阿霉素(DXR)负载到GO上,并研究了DXR的释放过程,发现GO对DXR的装载率可高达2.35 mg/mg,且DXR的装载率和释放动力学均可通过调节pH值进行调控[3]。Zhang等人[4]分别对GO进行了磺酸基和叶酸分子修饰以提高其在生理溶液中的稳定分散性和MCF-7细胞靶向性,并将2种抗癌药物阿霉素与喜树碱共同负载于其表面,表现出优于单药物的MCF-7细胞毒性。


  除了用于输送药物,石墨烯还可作为基因载体用于基因转染。GO表面含有大量的羧基、羟基等官能团,使其较容易地通过表面修饰得到带正电荷的石墨烯复合物以用于基因输送转染相关研究。目前,聚乙烯亚胺、壳聚糖和1-芘甲基胺等带正电荷材料已被用于修饰石墨烯并充当基因输送载体。张智军课题组[5]研究发现经聚乙烯亚胺(PEI)共价修饰的GO具有更低的细胞毒性,并表现出较PEI更好的基因转染效果,且能有效地将质粒DNA输送至细胞核。同时发现经PEI修饰的GO可同时负载siDNA和抗肿瘤药物DOX,将Bcl-2蛋白特异性的siRNA输送到肿瘤细胞内可有效下调细胞内Bcl-2蛋白的表达水平,增强细胞对DOX的敏感性,实现基因治疗与化疗对肿瘤细胞的协同治疗。Kim等人的[6]相关研究表明,利用PEG–BPEI–rGO载体在近红外光的辐照下高效的光热转换能力可有效促进负载质粒DNA的石墨烯载体从溶酶体内释放,实现近红外光可控的基因输送。


2.石墨烯的力学性质相关应用

  由于其碳原子层二维结构特点,石墨烯具有极好的力学性能,无支撑单层石墨烯的杨氏模量高达1.0 TPa,内禀强度为130GPa。因此,石墨烯可作为二维增强相应用于复合材料领域。


  羟基磷灰石(HA)的化学成分、晶体结构与人体骨组织中的磷酸钙盐相似,故其具有优异的生物相容性,适宜成骨细胞的粘附、增殖和成骨矿化。但其固有的共价键或共价键/离子键共存的特征,使其断裂韧性差,降低了HA的可靠性与服役时间。Zhang等[7]选用石墨烯纳米片(GNSs)作为HA的二维增强相,研究了HA及GNS/HA复合材料的力学性能(如显微硬度、弹性模量和断裂韧性)。结果表明,1.0 GNS/HA(质量分数)的弹性模量、显微硬度和断裂韧性分别比HA增加了约40%、30%和80%。GNS的拔出、GNS在晶粒之间的桥接、裂纹桥接、裂纹偏转等是GNS/HA复合材料中的主要增韧机制。Fan等[8]利用酰胺化反应将酪蛋白磷酸肽接枝到羧基化石墨烯的表面,制备了酪蛋白磷酸肽石墨烯复合物以改善石墨烯的骨整合能力。通过水热法一步合成了石墨烯/羟基磷灰石纳米棒复合新材料,研究发现该复合材料能显著提高羟基磷灰石的杨氏模量和力学性能。同时,与石墨烯和羟基磷灰石相比,该复合材料中含有40%羟基磷灰石时,表现出更高的骨整合能力、更好的生物相容性及优异的骨细胞繁殖诱导能力。


  作为人工关节材料之一,超高分子量聚乙烯(UHMWPE)虽然具有较好的耐磨性能,但在长期使用过程中磨损仍不可避免,产生的磨屑会导致周围骨溶解,进而引起无菌性松动,影响人工关节服役寿命。通过引入GO制备的GO/UHMWPE复合材料却表现出更为优异的硬度和在不同润滑介质下的耐磨性能。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)义齿基托材料具有出色的仿真美学效果和生物学性能,但其力学性能不能很好地满足临床要求,主要表现在耐磨性差等。在其中添加一定量的GO(质量分数约为0.1%),可有效提高其在人工唾液润滑介质下的耐磨性能。


3.石墨烯的热学性质相关应用

  由于在近红外光区域具有出色的光热转换能力,石墨烯与经修饰的石墨烯被大量研究并用于肿瘤的光热治疗。刘庄课题组于2010年发现与碳纳米管不同,经聚乙二醇(PEG)修饰的石墨烯可通过被动靶向富集到肿瘤组织,而且利用其在近红外区的良好光吸收能力,首次将石墨烯基材料应用于肿瘤的光热治疗[9]。该课题组还较系统地比较研究了具有不同尺寸和表面特性的rGO对体内肿瘤的光热治疗效果,发现水合肼还原的氧化石墨烯经PEG修饰后,在较传统功率低一个量级的808nm激光辐照下即可实现对肿瘤组织100%的消除。该课题组还制备了一种由四氧化三铁和金纳米粒子共同修饰的具有强顺磁性和高近红外吸收能力的氧化石墨烯纳米结构GO-IONP-Au,并经PEG处理获得了可在生理环境中稳定存在的GO-IONP-Au-PEG,体内和体外实验结果均证明该复合材料无显著毒性,且具有增强的肿瘤光热治疗效果。戴宏杰课题组研究发现,经PEG修饰后超小尺寸(约20nm)的rGO较GO具有更高的近红外区光吸收能力,可实现对肿瘤细胞的光热杀伤,且在所需剂量下并无明显生物毒性[10]。除通过光热治疗直接杀死肿瘤细胞,石墨烯的光热转换效应还被广泛应用于肿瘤的协同治疗相关研究中。


4.石墨烯的光学性质相关应用

  由于具有良好的分散稳定性、生物相容性和较强的荧光成像效果,石墨烯基材料作为一种新兴的荧光成像材料在生物活体成像领域具有广泛的应用前景。石墨烯自身在近红外光激发下即可发出荧光,且将一些荧光染料通过共价或非共价方式连接到石墨烯上可获得具有更优荧光性能的复合物。戴宏杰课题组制备了可在生理环境中可稳定存在的聚乙二醇化的氧化石墨烯(GO-PEG),并发现GO-PEG在可见和近红外光区均存在良好的光致发光性能,且易与细胞的自发荧光区分开,因此可用于进行细胞成像。Yang等[9]将染料Cy7连接到经聚乙二醇修饰的GO上,并通过静脉注射方式将其注入种植有肿瘤的小鼠体内,1天后经Cy7修饰的石墨烯大量富集在肿瘤内部,并呈现出强烈的荧光,实现了肿瘤的标记检测。此外,石墨烯量子点(GQDs)具有优异的水中分散性、出色的生物相容性和光致发光性质,是一种新兴的生物成像材料,可作为一种出色的细胞标记和成像材料。


5.石墨烯的电学性质相关应用

  石墨烯可促进电子传递,对一些生物小分子表现出优异的电催化行为,同时电化学检测方法具有易携带、灵敏度高、成本低等优点,故在高性能电化学生物传感器领域,石墨烯也受到广泛关注。为研究石墨烯在电化学生物传感器领域的应用前景,有必要对其基础电化学行为进行研究。Zhou等人[11]发现经rGO修饰的玻碳电极在0.1 M磷酸缓冲液中的电位窗口高到2.5V,与石墨修饰电极和玻碳电极接近,且对于多种无机和有机电活性化合物的电化学相应,rGO修饰电极表现出更低的电荷转移电阻。简便快捷地检测葡萄糖在预防、诊断和治疗糖尿病中具有重要意义。石墨烯作为电极表面和葡萄糖氧化酶氧化还原中心的导电原件,可很好地保持葡萄糖氧化酶的生物活性,并促进电子信号从酶的活性中心向电极表面的传递。且由于石墨烯具有较大的比表面积,酶可较好负载于其表面,基于此构建的葡萄糖氧化酶电化学生物传感器具有较宽的检测范围。


  在食品、医药、临床、人体健康等领域,过氧化氢(H2O2)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和多巴胺等生物分子的电化学检测具有重大的意义。经石墨烯修饰的电极具有出色的电催化活性,且其边缘存在的缺陷可作为活性位点,提高被检测生物分子的电子转移速度,降低电子转移电阻。石墨烯修饰的电极可在同时存在多种生物分子的条件下,对其中一种分子进行检测,具有分离效果好和检测限低等优点。


  在检测选定DNA序列和疾病相关变异基因方面,电化学DNA传感器具有灵敏度高、选择性高和成本低等优点,有望提供一种简单、准确和廉价的临床检测平台。石墨烯具有较宽的电势窗口,可直接检测氧化还原电位较高的核酸分子。Zhou等[11]报道了基于rGO的DNA电化学传感器,该传感器可有效区分DNA的4个自由基(鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)在电极上的电化学反应,并可在不需水解的前提下同时测定ssDNA和dsDNA。


6.石墨烯的生物学性质相关应用

(1)石墨烯的抗菌性

  Hu等人于2010年首次发现氧化石墨烯(GO)和还原后的氧化石墨烯(rGO)均具有优异的抗菌性[12],通过真空抽滤方法制备的GO和rGO膜同样表现出优异的抗菌性。深入研究结果表明,GO和rGO片层结构的边缘坚硬,可能会对大肠杆菌等细菌的细胞膜造成损伤。Akhavan等人[13]通过电泳沉积方法在不锈钢基底表面制备了GO薄膜,并通过水合肼还原得到了rGO薄膜,两者均会对细菌细胞膜的完整性产生破坏从而表现出优异的抗菌性。rGO薄膜较GO薄膜表现出对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)与革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)更好的抑制效果,这主要是由于当具有更加锋利边缘的rGO与细菌相互作用时具有更好的电荷转移特性。Akhavan等人进一步发现,团聚的GO和rGO能够通过捕获大肠杆菌使其与外界环境相分离,细菌由于不能有效获得营养成分而停止生长甚至死亡,因此GO和rGO表现出良好的抗菌性。Liu等人[15]通过比较发现石墨烯基材料的结构性质、片层大小均会影响其抗菌性能。在相同条件下,GO表现出最好的抗菌性,其次分别是rGO、石墨和氧化石墨;大尺寸GO具有更加优异的抗菌性能。同时发现石墨烯基材料的抗菌性主要来源于其尖锐的边缘与细菌的细胞膜相接触时而产生的膜应力,超氧阴离子氧化应激也是抗菌原因之一。Fan等人[16]合成了不同质量比的银/石墨烯复合物,然后与聚丙烯酸和聚甲叉双丙烯酰胺交联制成石墨烯复合水凝胶。当水凝胶中银与石墨烯的质量比为5:1时,该水凝胶表现出较好的力学性能以及优异的抗菌性和生物相容性。由于GO的制备简便、成本低廉,GO的抗菌性有望在环境和临床领域得到广泛的应用。不过,Ruiz等人研究发现[17]GO分散液和薄膜不但未能抑制细菌的增殖,反而起到促进细菌生长的作用。他们认为在之前研究中,GO之所以能够起到抗菌作用,其来源可能是GO制备过程中遗留的污染物或低估了GO浓度,而他们所使用的是经长时间透析的含杂质比较少的GO。这说明GO的制备工艺和质量均会严重影响细菌数量。


(2)石墨烯促进细胞生长分化

  Ruiz等人[17]发现GO薄膜可以通过促进哺乳动物细胞的粘附和增殖而提高其生长能力。石墨烯具有较低的细胞毒性,可加快骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞分化,其诱导分化速度与BMP-2相差无几。石墨烯表面适宜成骨细胞在其表面进行贴附,而且成骨细胞的贴附则直接关系着其增殖、分化等细胞活动,同时也有研究发现石墨烯有利于磷酸盐和钙盐在其表面矿化,即成骨矿化能力优异,这一系列的细胞活动对植入体表面新骨的生成具有促进作用。Chen等人[18]研究发现iPSCs可在GO和rGO表面粘附和增殖,但rGO会抑制iPSCs的分化,而GO却可以促进其分化,石墨烯的不同表面特性是调节iPSCs生长和分化行为的重要因素。石墨烯材料在骨组织工程领域具有良好的应用前景。

 

  石墨烯具有良好的生物相容性,可促进hNSCs的粘附并诱导其向神经元细胞分化而不是神经胶质细胞,且能够明显提升神经突的数量和平均长度,是一种潜在的神经接口材料。程国胜和戴建武等[19]合作开发了一种三维石墨烯泡沫神经干细胞支架材料3D-GFs。神经干细胞可在3D-GFs表面粘附增殖,且可进一步定向分化为星形胶质细胞尤其是神经元细胞。美国西北大学Ramille Shah课题组开发出了可3D打印石墨烯油墨(石墨烯含量高达60%),该油墨除石墨烯之外的材料是主要具有良好生物相容性的可降解聚酯材料,这使得其能够灵活安全地应用于生物医用领域(图1)。体内实验证实采用该油墨3D打印的石墨烯支架结构具有良好的生物相容性。体外实验表明,石墨烯支架不会影响干细胞生存,且能促进其继续分裂、增殖并转化成类似神经元的细胞。石墨烯有望在神经组织工程及神经干细胞移植治疗等领域得到应用。

资料来源:美国化学会,2015

图1.可根据需要采用3DG浆料通过3D打印制备适于不同用途的石墨烯结构

三、石墨烯的生物安全性

  由于其出色的结构、力热光电和生物学性质,石墨烯能够应用于生物医用多个领域,但要实现石墨烯材料的临床应用,其生物安全性是一个不可忽视的重要问题。石墨烯的主要组成元素是碳,而碳是组成生物有机体内最基本的元素之一,因此石墨烯材料在生物医用应用中具有天然的优势。由于制备工艺不同,石墨烯与其衍生物材料的物理化学性质(如尺寸大小、结构形状、表面化学状态等)不尽相同,因此其与生物分子、细胞、组织和器官等相互作用方式多种多样。但目前大量研究表明石墨烯是一种生物相容性良好的碳纳米材料。


  细胞毒性是评估材料生物安全性的重要指标之一。石墨烯材料一般均表现出较低的细胞毒性。虽个别研究发现GO呈现出较高的溶血率,但经过聚乙二醇、壳聚糖、吐温、人工过氧化物酶、葡聚糖、蛋白等修饰后,石墨烯材料的细胞毒性能显著降低。动物毒性是评估材料生物安全性的又一重要指标。虽石墨烯与其衍生物可在肺部富集并存在较长时间,进而导致肺部水肿和肉芽肿瘤的形成,诱发肺部损伤,但经聚乙二醇、葡聚糖、壳聚糖等聚合物修饰可显著降低石墨烯基材料的体内毒性。且有研究表明,生物体内存在的辣根过氧化物酶、人髓过氧化物酶等酶分子会引发石墨烯材料的降解,这种酶促降解行为可在很大程度上降低石墨烯材料的生物毒性尤其是长期生物毒性,使其更为安全有效地应用于生物医用领域。


  因其出色的结构、力学、热学、光学、电学和生物学等性质,石墨烯和其衍生物有望广泛应用于药物/基因输运、生物材料、肿瘤的光热治疗、生物荧光成像、组织工程、电化学生物传感和抗病毒/抗菌等生物医用领域。石墨烯在生物医用领域的巨大研究进展是鼓舞人心的,但不能否认所面临的挑战也同样艰巨。由于石墨烯基材料的多样性和生物系统的复杂性,对石墨烯与生物分子、细胞、组织、器官乃至生物体相互作用的机制缺乏系统详尽的研究。目前,石墨烯作用于生物分子和细胞后引发的生理生化反应以及机制通过体外实验取得了一些积极成果,但体内实验研究甚少。毫无疑问,如何在保持石墨烯材料出色特性的前提下,改善其生物相容性和稳定性是值得研究的重要方向。同时也应注意到,石墨烯虽然具有众多优异性质,但并非“万能材料”,需针对各具体应用对其进行修饰改进,开发相应的石墨烯衍生材料,这就需要具有不同学科背景的科研人员共同协作努力攻关。不过,随着研究的不断开展和深入,石墨烯材料必将在不远的将来在生物医用诊断和治疗领域取得实质应用。